针灸“足三里”“关元”穴对阳虚大鼠免疫功能影响的比较研究

陈雄华  刘又香  指导：王华  张德云

（湖北中医学院针灸骨伤系，武汉430061）

摘要：采用针刺、艾灸、针加灸不同的治疗方法，选用“足三里”“关元”两个强壮穴位，选择介导机体免疫的T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞为指标，以实验性“阳虚”大鼠为受试对象，对不同针灸疗法、不同穴位进行比较研究。结果表明：针灸可调节机体低下的免疫功能，且针加灸的作用优于单纯的针或灸的治疗；“足三里”穴的作用优于“关元”穴。

主题词：阳虚/针灸疗法  阳虚/免疫学  免疫系统/针灸效应  穴，足三里  穴，关元

    本项研究从“证”这一中医整体思维出发，选择具有“免疫监视”性的免疫指标（T淋巴细胞亚群、体外抗体形成细胞）作为观察指标，进行针刺、艾灸、针加灸不同治疗方法及“足三里”“关元”两个强壮穴位的比较研究，现报道如下：

    1  材料和方法

    1.1 实验动物

    Wistcr大鼠80只，6-7周龄，200-250g，雌雄兼用。同济医科大学动物部提供。

    1.2 主要药品、试剂及工作液

    醋酸氢化泼尼松悬液（AHP）：原液125mg/5ml，（江苏制药厂产品）；APAAP法免疫组化试剂盒（T-Subset-Rit)、淋巴细胞分层液(Ficoll-Urographin)（北京邦定泰克生物技术有限公司提供）；5%和15%新鲜羊红血球（SEBC）同济大免疫学教研室提供）；豚鼠新鲜血清——补体、1%肝素、pH7.2Hank's液、磷酸盐缓冲液等自行配制。

    1.3 主要仪器设备

    Olympus生物显微镜，国营华东电子管厂产酶标仪，北京产水平离心机，Sony恒温培养箱，低温电冰箱等。

    1.4.1 “阳虚”大鼠动物模型的建立^[1]Wistar大鼠每日每鼠大腿肌肉注射AHP3mg/100g体重，连续天。大鼠出现拱背、蜷曲、肢尾冷、挤卧在一起、神疲，反应迟钝、皮毛疏松、推动光泽、消瘦、少食等腰膝酸软（游泳存活时间缩短）、畏寒肢冷、精神不振、脱毛虚损状。根据中医阳虚证辨证参考标准^[2]，类似“阳虚”状态。

    1.4.2 分组  未造模前从80只大鼠中，随机抽取10只作为正常生理组（A组），余70只造模成功后，随机分为7个组，每组10只。分别为：模型对照组（B组），针刺“关元”组（C组）、艾灸“关元”组（D组）、针刺“足三里”组（E组）、艾灸“足三里”组（F组）、针灸“关元”组（G组）、针灸“足三里”组（H组）。

1.4.3 观察指标及检测方法  T淋巴细胞亚群：APAAP法即碱性磷酸酶——抗碱性磷酸酶桥联免疫酶染色法^[3]。此法目前已广泛应用于淋巴细胞分化抗原的分析研究。其特点是将第一抗体——小鼠抗大鼠T亚群单克隆抗体与待测抗原结合，以第二抗体——羊抗鼠lgG二抗起桥抗体作用，即其中一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化其底物显色来显示抗原的存在。其法的关键是外周血单个核细胞（PBMC）的分离：采血前大鼠空腹12h后摘眼球采血。取肝素0.2ml抗凝血2ml，用PBS稀释3倍，加入到含有3ml淋巴细胞分离液的试管上层，血液沿管壁缓缓加入，使两液间保持清晰界面。离心（200r/min）15min。吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层，加5倍PBS混匀，离心（1000r/min）5min，去掉上清沉淀即为单个核细胞。体外抗体形成细胞^[3]：QHS法即定量溶血分光光度测定法。此法是根据试验的原理衍化而来，可用在测定由一定数量的B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞后释放的血红蛋白（以OD值表示），以反应机体体液免疫功能：其法的关键是免疫大鼠及脾细胞悬液的制备：能5%SRBC2ml注射大鼠腹腔，4天后拉脱大鼠颈椎处死，取出脾脏放在已加入8ml左右Hank’s液的平皿中，用100目的不锈网研磨后，经尼龙布过滤后放入试管中，离心（100r/min）10min洗两次，将沉淀的脾细胞重悬于Hank’s液中细胞计数后配成1X10⁷/ml细胞浓度。

1.4.4 治疗方法  参照华兴邦等的动物腧穴标准定位法[4]，选择“足三里”穴（左右交替使用）和“关元”穴，C、E二组采用28号1.5寸毫针常规进针，进针后平补平泻，每5min行针1次，留针15min;D、F二组采用自制的直径0.8cm,长5cm艾灸于穴位上施温和灸，灸15min；G、H二组针刺同时艾灸（操作同前），持续15min。含有艾灸的治疗组在穴处剪净毛，治疗时以大鼠相对安静为度：治疗于每日8：30-11：30、14：30-16：30进行，每日行1次，共14次为一个疗程。

1.4.5 实验数据的统计与处理  所有计量资料结果用均数±标准差（x±s）表示，统计学用t\F\q检验。

2．实验结果

2．1 造模前后大鼠免疫功能比较见表1。

表1 造模后T亚群和QHS水平（OD值）

         比较（x±s）

 

CD₃(%)      65.2±8.17         35.5±5.41^△

CD₄(%)      45.3±6.31         28.1±4.34^△

CD₄(%)      28.8±5.20         19.2±3.12^△

CD₄/CD3       1.615             1.095

注：表中“△”表示B组比较P<0.01

从表1中实验数据显示，根据成组资料均数比较t检验求得tCD₃₍₁₀₎=9.92,tCD₄₍₁₀₎=8.73,t_CD4(10)=7.61,t0.01(10)=3.17,P<0.01,造模后大免疫功能降低，说明了免疫功能低下是阳虚证的机制之一，证明了造模成功。

2.2 治疗后各组大鼠免疫功能的变化比较见表2。

 

                      C组         D组       E组        F组       G组       H组

CD₃(%)      55.3±7.32   55.5±7.32   63.5±7.45    62.4±7.41  64.8±7.73   65.1±7.75

CD₄(%)      35.2±4.25   35.4±4.26   41.4±5.28    42.4±5.32  44.2±5.32   45.4±4.41

CD₄(%)      23.4±3.16   23.5±3.16   27.5±4.56    27.6±4.58  28.3±3.44   29.1±4.62

CD₄(%)        1.52        1.52       1.51         1.52       1.57       1.57

表2实验数据显示：各治疗组与模型组比较CD₃、CD₄、CD₃、QHS水平增高，经t检验其差异有显著或非常显著性意义（P<0.05,P<0.01）说明针灸治疗能调节低下的免疫功能。经F分析后：FCD₃=250.65、FCD₄=211.35、FCD₃=183.21,以r(组间)=7，r（组内）=72查方差分析F界值表，得P<0.01；说明各治疗组间CD₃、CD₄、CD₃有差别。进一步作q检验后C组与D组、E组与F组、G组与H组各指标间差异无显著性意义（P>0.05）;G组、H组与C、D、E、F组分别两两比较，CD₃、CD₄、CD₈间差异有非常显著性意义（P<0.01）。说明针刺与艾灸两种治疗方法对免疫功能的影响不如针加灸的作用。

2.3 治疗后含“足三里”穴与含“关元”穴治疗组免疫功能的变化情况  见表3。

（C-D-G）组成       （E+F+H）组

CD₃(%)                       58.3±7.33                       63.7±7.52

CD₄(%)                      38.3±4.81                       43.1±5.24

CD₄(%)                       24.8±3.58                       28.1±4.61

CD₄/CD₈                      1.53                       1.53

从表3实验数据显示：含“足三里”穴组与含“关元”穴组比较，根据成对资料均数的t检验：tCD3=2.167    tCD₄=2.205   tCD₈=2.063而查t界值表t0.05(29)=2.045,t0.01(29)=2.462。故P<0.05，说明“足三里”穴对提高免疫功能的影响优于“关元”穴。

3         讨论

祖国医学认为阳虚是阳气偏衰、正气不足、阴阳失调，机体呈现机能衰退、代谢活动减弱、热量不足的病理状态。许多研究资料表明虚证与机体免疫功能低下有关：

在古代运用针灸治疗时，由于学术发展、师承、地区、特定环境、疗效等因素的影响形成了重针派、重灸派等诸流派，如东晋的葛洪、唐朝的五焘、南宋的窦材等认为“急症用灸”“灸以扶阳”，主张“唯取灸法”“灼艾第一”。而元朝的窦汉卿、唐朝的甄权、宋朝的许希偏重用针，认为“拯救之法，妙用者针”，“必欲治病，莫如用针”。其实针刺和艾灸都属于外治范畴，二者虽然所用器材和操作方法不同，但都是通过腧穴作用于经络、脏腑，“通其经脉，调其血气”，鼓舞机体正气，使阴阳调和、阴平阳秘，达到治疗的目的，长期以来，针和灸在治疗上常结合应用，本项实验结果亦表明针、灸、针加灸三种治疗方法均可调节机体的免疫功能，而针加灸的作用更佳。

“足三里”“关元”二穴都是进行针灸治疗的常用要穴，本项实验结果表明，“足三里”穴对提高机体免疫功能方面明显优于“关元”穴。在本实验中，选用的是经注射AHP后的“阳虚” 大鼠作为受试对象。现代医学认为AHP影响到了外周的二级免疫器官——脾脏是各种免疫细胞居住、增殖并进行免疫应答及产生免疫效应物质的重要基地。祖国医学认为“阳虚”的病变机理一般多以脾肾阳虚为主。因此，广而言之，对于“阳虚”的认识，祖国医学与现代医学在某方面有一致的见地。足三里为足阳明胃经之合穴，阳明经乃“两阳合照、阳气最盛”之经，“经能统穴”而“合治内腑”，胃与脾互为表里，脾为后天之本，肾为先天之本，先天与后天又互为依赖与濡养。机体的虚衰，则脾、胃、肾的功能亦衰退。现代医学的临床与实践已证明针刺足三里穴能调整胃液分泌，增加正常人胃酸的排出量，对胃蠕动有明显的兴奋作用。所谓“三里有白术之强，桂附之热，参茸之功，硝黄之功”，说明足三里有健运脾阳、培土化元、温中散寒之功，从而达到防病保健，提高机体的免疫功能。“关元”穴属任脉，为十二募穴之一，“任主胞胎”。从古代文献及现代临床与实践上看，“关元”穴多用于治疗泌尿、生殖、妇科疾患，其功效表现为调和气血和补肾固本。因此，根据中医基本理论，“阳虚”的病理机制，按“足三里”“关元”各自的功能特点，本实验结果证明“足三里”穴提高机体免疫功能的效果优于“关元”穴，然其作用机理有待于进一步探讨。

4         参考文献

1．  张伟荣，等，中医实验病理学，上海科学普及出版社，1995：55

2．  沈自尹，中医虚证辨证参考标准，全国中西医结合虚证与老年病防治学术会议，1982

3．  毕爱华等，医学免疫学，北京：人民军医出版社，1995：318

4．  华兴邦等，大鼠穴位图谱的研制，实验动物与动物实验，1991：（1）：1